金银花在开花期的内在成分快速变化会严重影响其产品品质。目前大多数的研究主要集中在检测几个目标化合物，但这些研究不能提供化合物变异的全面轮廓。因此，关于化合物的组成与金银花质量之间的关系尚不清楚。针对这一问题，本研究建立了基于气相色谱-质谱（GC-MS）和超高效液相色谱-高分辨质谱（UHPLC-HRMS）的分析方法，用于高度全面地表征开花期金银花中的化合物变化。包括autoGCMSDataAnal和AntDAS在内的先进化学计量方法首次应用于GC-MS和UHPLC-HRMS中的共洗脱化合物。基于所建立的策略，我们共筛选出约70种挥发性化合物和38种难挥发性化合物，这些化合物与金银花的品质有关。本研究结果表明，约有9种化合物可作为金银花质量评价的标志物。

　　1. 本研究采用 GC-MS 和 UHPLC-HMRS 的非靶向代谢组学技术研究金银花的代谢物；

　　译名：金银花的质量评价：结合GC-MS、UHPLC-HRMS和化学计量学方法

　　这项工作中仪器和数据分析的工作流程如图1所示。我们通过结合基于气相色谱-质谱（GC-MS）和超高效液相色谱-高分辨质谱（UHPLC-HRMS）的非靶向代谢组学来分析金银花样品，并将收集的数据文件分别导入我们开发的化学计量软件autoGCMSDataAnal和AntDAS以完成自动鉴定过程。我们筛选在不同开花阶段表现出显着差异的化合物进行热图分析。最后，我们将GC-MS和UHPLC-HRMS中鉴定得到的化合物合并分析，用于进行金银花的质量评价。

　　在基于GC-MS和UHPLC-HRMS的非靶向代谢组学研究中，数据分析是直接影响下游结果(包括化合物筛选和鉴定)的关键步骤。因此，我们首先对本研究中使用的化学计量学方法(即autoGCMSDataAnal和AntDAS)的性能进行了评估。GC-MS和UHPLC-HRMS的数据分析有很大的不同，我们将在本节中单独进行研究。

　　autoGCMSDataAnal可以自动执行总离子色谱(TIC)峰的解卷积、化合物筛选和鉴定。我们将TIC峰检测结果的一个例子显示在图2A中，其为金银花的质控（QC）样品。我们在TIC中可以发现总共239个TIC峰。图2A中的插入图显示了各种情况下的峰检测结果，包括共洗脱TIC峰的识别和小峰的识别。显然，我们可以成功地提取具有可接受信噪比( 10)的TIC峰，并在此基础上通过多元曲线分辨-交替最小二乘法进行TIC峰解卷积。

　　A，基于autoGCMSDataAnal的典型GC-MS TIC检测结果。B，TIC峰的分离度结果。C，B中TIC峰下的两种分离化合物。D，GC-MS中已注释化合物的实例。E， Com65的化合物鉴定。F，计算GC-MS数据集中QC样品峰面积的相对标准偏差（RSD）。

　　图2B–F为TIC峰解卷积和化合物鉴定的一个示例。图2B显示了检测到的TIC峰78#，它是性能良好的高斯曲线。分析人员可以确定它为单一化合物。然而，在autoGCMSDataAnal的帮助下，两种严重共洗脱的化合物被解卷积，并显示在图2C中 (即第65种化合物在TIC峰中获得约82%的信息，第66种化合物获得约18%的信息)。最后，我们将两种去卷积的化合物注释到化合物列表中，每行代表不同样品中化合物的含量，每列表示收集样品中化合物的峰面积。图2D显示了GC-MS数据集中的一部分化合物列表。

　　我们根据所筛选化合物的高分辨质谱图进行化合物鉴定。所有质谱图都输入到美国国家标准及技术协会数据库（NIST）进行鉴定。为了提高化合物鉴定的质量，我们使用保留指数(RI)，以便最大限度地减少每个质谱图的候选化合物。第65个化合物鉴定的结果显示在图2E中。借助于高分辨质谱和RI，该化合物被鉴定为谷氨酸，匹配因子(MF)为0.990，RI置信度为2。图2F显示了解卷积化合物的相对标准偏差(RSD)。在223种化合物中，157种化合物的RSD%低于20%，184种化合物的RSD%低于30%，这在常规分析中是可以接受的。

　　数据分析工作流程包括提取离子色谱图(EIC)的提取、特征检测、特征对齐和注释，以获得用于下游分析的特征列表，包括方差分析和PLS-DA。AntDAS的优势在于当同时分析多个样品时，它可以识别属于一种化合物的源内碎片离子。

　　我们以金银花QC样品为例。图3A显示了来自UHPLC-HRMS的QC样品的TIC。约50分钟的梯度洗脱时间用于最大程度地分离样品中的化合物。我们利用AntDAS从数据文件中提取了大约11636个EIC，并且检测到超过33100个特征，这些特征具有可接受的信噪比( 10)。图3B中给出了在一个EIC (m/z 167.0338)的AntDAS提取的所有峰值例子。AntDAS提取了14个峰，其中3个峰信号强度较高(2号和6号)，11个峰信号强度较低。从该图可以看出，AntDAS可以实现对化合物信息和仪器背景噪声的有效识别，完成EIC中色谱峰的高质量提取。进一步的研究表明，共4015个特征在数据依赖性采集（DDA）模式下得到了二级谱图。

　　A，基于UHPLC-HRMS的TIC。B，EIC的AntDAS特征提取结果。C，一部分的注释特征列表。D，相同ID 5119的注释特征对应的色谱洗脱曲线。E，基于AntDAS中的内源碎片离子鉴定获得的MS1光谱(上图)以及E中对应于离子205.0970 Da的MS2光谱图。F，计算UHPLC-HRMS数据集中QC样品峰面积的相对标准偏差。具有相同ID 5119的特征的化合物鉴定结果见E。

　　图3C–F描述了AntDAS中的化合物注释和化合物鉴定步骤。在AntDAS的帮助下，我们可以获得特征列表(行×列，其中19927和60分别是特征和样本的数量)。ID为5119的化合物中所有EIC的色谱图如图3D所示。ID 5119的注释化合物被鉴定为色氨酸，其MS1和MS2质谱如图3E所示。我们通过QC样本对AntDAS在分析UHPLC-HRMS数据集方面的性能进行了统计研究。AntDAS共记录了26811个特征，其中分别有9404、15086和17723个特征的RSD低于10 %、20 %和30 %，结果显示在图3F中，这表明AntDAS可用于分析金银花的代谢轮廓。

　　我们通过分析金银花的GC-MS数据得到436 × 60的化合物列表，其中436和60分别是化合物和样品的编号。在p 0.01的置信水平下我们，通过方差分析筛选出在五个开花期之间表现出显着差异的挥发性化合物。同时，我们过滤掉样品中不到80%的化合物，最终筛选出169个化合物。我们将这些化合物的质谱导入NIST进行鉴定，有50多个化合物获得了0.7以上的MFs。我们在实验室用标准品进一步进行验证，结果表明有28个化合物可以被成功验证，其详细信息如表1所示。糖类物质在筛选的化合物中占很大比例。

　　我们使用基于化学计量学的OPLS-DA、GC-MS和UHPLC-HRMS对筛选的化合物的质量进行验证。图4显示了来自OPLS-DA的前两个潜在变量的得分图上的样本分布结果。OPLS-DA模型是基于GC-MS得到的28个化合物，结果如图4A所示。R2X(cum)、R2Y(cum)和Q2(cum)的模型参数分别为0.829、0.823和0.71。R2X和R2Y参数可以分别衡量OPLS-DA模型对GC-MS数据矩阵(X)和分组矩阵(Y)的插补结果。Q2是模型预测能力的指标。R2X(cum)、R2Y(cum)和Q2(cum)的结果表明，OPLS-DA模型为当前的分析提供了可接受的结果。

　　图4 A，基于GC-MS鉴定的化合物OPLS-DA结果。B，基于UHPLC-HRMS鉴定的化合物OPLS-DA结果。“G1”、“G2”、“G3”、“G4”和“G5″”分别表示幼蕾期、青蕾期、二白期、白蕾期和银花期。

　　它能合理地区分五个花期的样品。显着差异的样本来自G1和G5期，因为来自这两组的样本在OPLS-DA的得分图中最远。来自G2、G3和G4阶段的样品位于得分图的中间部分。图4A的结果表明，不同花期主要代谢物变化的相似性可能不利于区分G3和G4阶段的样品。

　　我们将获得的UHPLC-HRMS数据导入AntDAS进行分析，以获得19927×60的特征列表，其中19927和60分别是特征和样本的数量。通过在AntDAS中设置p0.01和样本百分比为80%，我们共筛选出14886个在不同花期之间表现出显着差异的特征。AntDAS能将这些特征排列到各种化合物中，构建用于化合物鉴定的MS1和MS2光谱。我们将公共化合物库(导入AntDAS进行鉴定，可鉴定出约646种化合物。手动验证表明，38种化合物可以与可接受的MF值匹配，其中16种化合物可以与MS1和MS2光谱匹配。最后，8个化合物可以通过标准品验证。化合物鉴定的详细信息见表2。

　　基于UHPLC-HRMS分析得到的38种化合物的OPLS-DA模型如图4B所示。结果表明，模型参数R2X(cum)、R2Y(cum)和Q2(cum)分别为0.996、0.709和0.663，均大于0.5。OPLS-DA能合理地区分五个花期的样品。其中，G5期的样品差异显着。图4B中的结果表明，在OPLS-DA模型的构建中，UHPLC-HRMS数据对于处于开花期的金银花样品具有更好的可靠性，这可能是因为金银花的次生代谢物更有利于样品的区分。

　　我们使用鉴定出的化合物绘制了热图，并进一步探索了化合物在不同花期的变化模式。如图所示，系统聚类分析(HCA)可用于化合物的分类。归一化峰面积表示化合物的含量，绿色和红色方框分别代表低水平表达和高水平表达。图5A中的结果显示，大多数鉴定化合物的含量在幼蕾期最高，有机酸如咖啡酸和绿原酸以及脯氨酸和甘氨酸的含量在青蕾期时最高。半乳糖含量在二白期和白蕾期积累最多。我们还可以从图5中发现，糖化合物如甘露糖、塔格糖、半乳糖和阿拉伯糖的含量在银花期最高。硬脂酸含量在整个开花阶段变化不大。

　　图5 A，GC-MS结合autoGCMSDataAnal鉴定的化合物热图。B，UHPLC-HRMS结合AntDAS鉴定的化合物热图。蓝色、红色、黄色、绿色和棕色字体分别表示糖、氨基酸、脂肪酸、类黄酮和有机酸。黑色字体包括花青素等化学成分。“G1”、“G2”、“G3”、“G4”和“G5″”分别表示幼蕾期、青蕾期、二白期、白蕾期和银花期。

　　图5B中38种化合物的分布特征表明，化合物在不同花期积累。黄酮类化合物和有机酸含量在幼蕾期积累最高。与幼蕾期相比，青蕾期和二白期这些化合物的含量有所下降，但绿原酸的含量在此阶段达到最高。花青素中 矢车菊素 3-O-槐糖苷和矢车菊素-桑布糖苷的含量在整个白蕾期均呈上升趋势，在银花期含量最高。氨基酸含量在银花期达到最高。

　　我们通过结合GC-MS和UHPLC-HRMS的代谢物进行数据融合。我们基于频率计数策略筛选了可能对不同花期鉴别有价值的代谢物。统计10种组合中各代谢物出现显着差异(p 0.01)的频率。在这种情况下，我们可以得到所有化合物的频率，结果如表3所示。一种化合物的频率越高，其对花期的鉴别价值越大。在本研究中，我们只选取了频率为10的化合物进行接下来的数据分析，其中包括9个化合物，分别是肌醇、精氨酸、木犀草素、脱脂蛋白、槲皮素-3-O-木糖苷、异鼠李素-3-O-葡萄糖苷、珊瑚菜内酯、矢车菊素3-O-槐糖苷和矢车菊素-桑布糖苷。9种化合物的含量分布如图6A-I所示。其中精氨酸、矢车菊素3-O-槐糖苷和矢车菊素-桑布糖苷随花期含量逐渐增加，其余6种化合物含量略有下降。

　　“G1”、“G2”、“G3”、“G4”和“G5″”分别表示幼蕾期、青蕾期、二白期、白蕾期和银花期。

　　在银花期(G5)，黄酮类化合物的含量低于其他各阶段，表明其可能是不可多得的食品或医药原料。虽然大部分氨基酸和类黄酮等化合物在幼蕾期和二白期的含量最高，但产量较低，难以为农民带来效益。肌醇、木犀草素、脱脂蛋白、槲皮素-3- o -木糖苷、异鼠李素-3-O-葡萄糖苷、珊瑚菜内酯6种化合物含量均低于二白期(G3)和白蕾期(G4)。相比之下，二白期和白蕾期时期的化合物在前两个花期和最后一个花期间是平衡的，主要集中在槲皮素-3-O-木糖苷、芍药素-3-O-葡萄糖苷等化合物的积累。因此，中国市场上最受欢迎的花期为二白期和白蕾期。

　　基于筛选的9种化合物，我们采用Fisher线性判别分析(FLD)和PLS-DA等监督分类方法对不同花期的花进行区分。Fisher线A所示，PLS-DA的结果如图7B所示。我们从图7A和图7B可以清楚地发现，FLD和PLS-DA都可以很好地分离不同花期的样品。特别是，图7A中的样品分布结果比图7B中的样品分布结果更令人接受，因为在幼蕾期和青蕾期(分别用图7中的“G1”和“G2”标记)之间的样品可以用FLD更准确地分组。

　　图7 A，基于9种化合物的Fisher判别结果。B，基于9种化合物的PLS-DA结果。C，两种方法的验证结果和预测精度。“G1”、“G2”、“G3”、“G4”和“G5″”分别表示幼蕾期、青蕾期、二白期、白蕾期和银花期。

　　我们采用Monte-Carlo模拟研究了两种方法的预测能力。在本研究中，Monte-Carlo模拟重复10000次，在每次重复中，每个花期的样本随机分为两组，即校准组(80%样本)和预测组(剩下的20%样本)。两种方法的验证结果和预测精度如图7C所示。尽管FLD的验证正确率(97.5%)低于PLS-DA(100%)，其预测正确率(79.8%)高于PLS-DA(73.4%)。FLD似乎更适合于区分不同花期的金银花样品。

　　在此基础上，我们筛选并鉴定了9个与金银花品质高度相关的化合物。结果表明，筛选的化合物能较好地利用FLD对不同花期的样品进行分类。结果表明，所筛选的化合物可作为金银花质量控制的潜在标记物。

　　本研究以GC-MS和UHPLC-HRMS非靶向代谢组学技术为基础，对不同花期的金银花化合物进行了系统、全面的分析。我们首次采用GC-MS数据分析软件autoGCMSDataAnal和UHPLC-HRMS数据分析软件AntDAS对金银花样品进行分析。本研究为金银花的采收提供了依据，为金银花不同花期花品质的评价提供了新的信息支持。该方法为当前复杂食品样品分析提供了一种新的方法。

　　本公众号已与浙江慧通测评动物实验中心搭建紧密的合作关系：该动物中心已获得动物使用许可，如您需要含药血清制备-药效物质分析、灌胃给药、造模、药理、毒理以及相关实验（sci）外包服务，欢迎联系我们！

　　【福利时刻】毕业季找工作点击链接，多家企业30W+年薪工作招聘任你选（赶紧点击进入注册，上传简历吧~ ） 。